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专利起底Covid-19,如何确诊?

       2020年的春节,对受疫情的威胁的中国人来说无疑是艰难的。相信很多国人每天关注的第一件事就是“今天有多少例确诊?”。2月11日,世界卫生组织在瑞士日内瓦宣布,将本次2019-nCoV新型冠状病毒引发的肺炎命名为“Covid-19”。
 
       众所周知,Covid-19的症状包括“发热、乏力、干咳”,部分患者会伴有鼻塞、流涕等症状,但这类症状普通病毒感冒也会有,而自然界存在的病毒种类数不胜数,即使是冠状病毒也是一个十分庞大的家族。面对汹涌的疫情,医生如何在第一时间快速区分是否为“2019-nCoV”病毒感染,很显然是抗击疫情的关键。下图为《柳叶刀》杂志公开的本次“2019-nCoV”病毒的真容。
 
       在诸多的新闻中,我们经常看到这样的报道“某某核酸诊断为阳性,最终确诊”,“某某伴有发热乏力症状,第1天核酸检测为阴性,第2天核酸检测为阳性,最终确诊”。通过这些新闻我们捕捉到一个诊断的关键词“核酸检测”。没错,核酸检测是目前疫情中十分重要的一个检测技术,那么针对Covid-19的核酸检测是如何操作的呢?
 
       首先我们回顾一下相关信息,2019年12月8日首例不明病毒肺炎案例报道,2020年1月10日,该病毒的测序工作已经完成,相关数据已经上传到GenBank(与2003年的非典相比,这是一个质的飞跃)。 在基因序列测序完成后,各家体外诊断公司迅速展开工作。硕世生物发布公告称,针对本次新型冠状病毒引发的疫情,公司基于荧光PCR的技术于1月13日开发了核酸检测试剂盒。2020年1月14日,华大基因官方表示:华大基因下属公司第一时间研制成功了新型冠状病毒核酸检测试剂盒,而根据报道,华大基因开发的核酸检测试剂盒同样基于荧光PCR技术。
 
       看到这里我们又获得了一个关键信息,无论是硕世生物还是华大基因的核酸检测试剂盒均基于荧光PCR技术。这对于我们来讲又是一个新鲜的词汇。而受疫情影响,两家公司目前均未公开针对本次疫情核酸检测试剂盒的相关专利,但是我们不能止步于此,通过深度分析两家公司的专利,我们发现硕世生物此前针对禽流感病毒开发了核酸诊断试剂盒(CN107287346A),而且其采用的技术同样为荧光PCR,下面我们通过这件专利技术来一窥“核酸检测”的真容。
 
       专利CN107287346A公开了一种用于禽流感病毒N亚型基因分型的多重荧光定量PCR检测试剂盒及其应用。该试剂盒包括以下各组分:核酸扩增反应液、酶混合液、禽流感病毒N亚型反应液A、禽流感病毒N亚型反应液B、禽流感病毒N亚型反应液C、阳性对照A、阳性对照B、阳性对照C和空白对照。其中禽流感病毒N亚型反应液A包括六条分别用于检测禽流感病毒N1-3亚型的引物,以及三条分别用于检测禽流感病毒N1、N2、N3亚型的探针。禽流感病毒N亚型反应液B包括六条分别用于检测禽流感病毒N4-6亚型的引物,以及三条分别用于检测禽流感病毒N4、N5、N6亚型的探针,禽流感病毒N亚型反应液C包括六条分别用于检测禽流感病毒N7-9亚型的引物,以及三条分别用于检测禽流感病毒N7、N8、N9亚型的探针。上述提及的所有探针5′端均标记有荧光报告基团,3′端均标记有荧光淬灭基团。
 
       为了更好的了解专利技术,首先我们了解一下何为“PCR技术”,PCR技术的全称为聚合酶链式反应,是一种用于放大扩增特定的核酸片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊核酸复制。引物与模板的互补序列配对结合,在聚合酶的作用下以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新链,而新链的核酸信息与模板相同。实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。
 
       在检测中,将带有荧光标记的探针与待测标本模板混合,适温延伸的热循环,并遵守聚合酶链反应规律,与模板互补配对,当探针完整时,由于淬灭基团靠近报告基团而极大降低了报告基团发出的荧光。但随着扩增反应的进行,引物与模板结合的不断延伸,使得探针与模板的结合被Taq酶(5′→3′外切核酸酶活性)切断,报告基团与淬灭基团分离,产生荧光信号。如下图所示:
 
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       在每次PCR循环中,都有新的探针被破坏,报告基团被剪切,发出荧光信号,因此荧光信号强度的增加与扩增产物的数量成正比。通过实时检测与之对应的随扩增而变化的荧光信号强度,同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照,即可得出待测标本模板的拷贝数。
 
       硕世生物开发的CN107287346A专利技术可以灵敏,快速,特异的检测出模板中禽流感病毒的基因拷贝数。通俗一点理解,如果患者感染禽流感病毒,那么基于患者提供的待测标本模板中即含有了一定量的禽流感病毒基因拷贝数,这个数量远高于未感染患者,检测中,特异性的探针与模板结合,同时引物也与模板结合开始复制延伸。随着反应的进行,探针与模板的结合被切断,发出荧光信号,扩增数量越多荧光信号就越强,通过荧光信号强度的变化,对比阳性对照组,就可以判断患者是否感染后禽流感病毒。那么同理,理论上讲,如果设计合理的针对本次“2019-nCoV”病毒的引物以及探针,基于荧光PCR技术,就可以检测患者是否感染“2019-nCoV”病毒,进而确定是否为Covid-19患者。而无论是引物还是特异性探针的设计都基于“2019-nCoV”病毒核酸序列的快速获取,在此让我们再次为快速完成病毒测序工作的国人点赞。
 
       任何疾病的发展都有一定的时间,核酸检测也会存在一定的假阴性结果,但在目前抗疫形势严峻的情况下,核酸检测快速、灵敏以及可操作性,无疑在本次疫情中功不可没。
 
       对于普罗大众来说,大家都惊异于此次疫情的凶猛,甚至因为数字的快速增长而感到恐慌。但事实上,透过数字我们更应该看到,与2003年的非典相比我国在基因测序和核酸诊断技术方面的飞速发展,同时也更应该坚信我们一定可以获得胜利。武汉加油!中国加油!
 
作者:北京品源知识产权管理咨询有限公司 郝雪敏